En este apartado no pretendemos ofrecer un gran texto sobre las partes de un microscopio y los tipos que hay, esta información se pueden obtener de innumerables obras tanto en Internet como en material escrito, lo único que pretendemos es dar una información básica dirigida fundamentalmente a dos aspectos, el manejo para la realización de las observaciones de los hongos y unas orientaciones dirigidas a aquéllas personas que puedan tener un interés en la adquisición de uno para uso micológico.
En la actualidad podemos adquirir un microscopio que nos permita hacer todas las observaciones necesarias de los hongos tal y como las presentamos en este trabajo por mucho menos de lo que vale una cámara de fotos réflex como la que cualquier aficionado a la micología suele disponer.
Un microscopio óptico o compuesto a diferencia de un microscopio simple o más conocido como una clásica lupa utiliza una luz que atraviesa los objetos que queremos observar y de esta forma puede conseguir aumentos mínimos de 40 a 50 y máximos de 1000 a 2000 aumentos en los microscopios normales, mientras que una lupa clásica utiliza luz reflejada en los objetos y consigue muchos menos aumentos, 2 a 10 en las lupas manuales y hasta 40 o 50 en las más sofisticadas o también llamadas microscopio simples o estereomicroscopios.
Microscopio simple, lupa binocular o estereomicroscopio
La lupa es muy útil y necesaria en micología porque ayuda a ver mejor lo que apenas apreciamos a simple vista, son muy cómodas de usar y no requieren ningún tratamiento a los objetos que vamos a observar.
El microscopio óptico por su parte nos permite ver lo que no podemos de ninguna manera ver a simple vista, por eso hemos decidido llamarle el “mundo microscópico” ya que nos muestra aspectos absolutamente nuevos y desconocidas para nuestros sentidos. Sin embargo presenta más dificultad de uso que la lupa, especialmente en lo que se refiere a los objetos o muestras a observar, deben ser o transparentes, o diminutos o secciones lo suficientemente finas para dejar pasar la luz.
PARTES DE UN MICROSCOPIO OPTICO CONVENCIONAL
Evidentemente a nivel profesional existen microscopios ópticos enormemente complejos y por supuesto muy caros de los que obviamente no vamos a tratar porque sencillamente para el estudio de los hongos a nivel personal no los necesitamos. Un microscopio óptico convencional adecuado para el estudio de setas y hongos comprende las siguientes partes:
- Soporte mecánico o pie. Es obviamente el elemento que soporta el resto de componentes del microscopio. Sin duda es el menos importante, no obstante hay algunos aspectos que tenemos que valorar como su peso, estética, ergonomía, disposición para la observación, comodidad, etc.
- Sistema de iluminación. En la parte baja del pie se encuentra la fuente luminosa que en los microscopios muy simples (a desechar para estos usos) suele ser un simple espejo que nos refleja la luz ambiental o de una lámpara independiente, en otros es una lámpara incorporada al dispositivo. La luz es un aspecto importante en la observación, las lámpara halógenas dan una luz más fría que las incandescentes y por tanto alteran menos los colores. También es importante si tiene regulador de luz a veces no es necesaria utilizar toda la potencia de la lámpara y se alarga la vida de ésta e incluso se mejora la visión del objeto cuando es muy claro, en caso de hifas incoloras.
Fuente de luz halógena regulable
Interruptor y control de intensidad de luz
- Filtros y condensador. Por encima de la lámpara debe haber un soporte para cristales de colores, filtros, que en ocasiones son interesantes para destacar ciertos objetos y sobre todo una lente que concentra la luz en un punto, el condensador, con su correspondiente mando para subirlo o bajarlo y mejor todavía si tiene tornillos laterales para ajustarlo perfectamente al centro.
- Diafragma. Entre los filtros y el condensador es importante la presencia del diafragma que igual que en las cámaras fotográficas sirve para cerrar o abrir la cantidad de luz que llega del foco de iluminación. Al cerrar el diafragma lo que nos permite es ver mejor cosas muy claras y con poco contraste y conseguir mayores profundidades de campo.
- Platina. Por encima del condensador nos encontramos el soporte o platina donde tenemos que colocar la preparación del material que vamos a observar, presenta un orificio central por donde la luz atraviesa el objeto. A diferencia de una simple lupa donde el objeto que vamos a observar está estático y son las lentes las que acercamos o alejamos para enfocar el objeto, en un microscopio ordinariamente es justo al contrario, las lentes son estáticas y lo que tenemos que mover es el objeto tanto para enfocarlo como para observar las distintas partes. Como estamos manejando grandes aumentos, pequeños deslizamientos del objeto se multiplican por 400, 1000 o más veces por lo que es muy importante que la platina disponga de buenos mecanismos para sujetar la preparación y sobre todo para desplazarla en sentido lateral y profundo de forma suave y delicada. Entre los mandos de movimiento de la platina los más importantes son las ruedas macrométricas y micrométricas que nos desplazan la platina de arriba a abajo para el enfoque, se usan constantemente y deben poseer buenos engranajes, suaves, con pequeños desplazamientos, etc.
- Objetivos. Sin duda los elementos más importantes de un microscopio, los más caros y por tanto en los que más nos deberíamos fijar a la hora de adquirir uno son sin duda los objetivos. Los objetivos en número de 2 a 5 van roscado sobre un elemento el revólver que gira para colocar en el centro los distintos objetivos. Los objetivos en realidad son un conjunto de lentes montadas una sobre otra dentro de un tubo para conseguir el mayor aumento posible, la mejor definición de los puntos y líneas de lo que observamos, la mayor profundidad de campo, la mínima deformación de los objetos observados y la menor aberración cromática o de colores. Para corregir algunos de estos problemas, se fabrican objetivos especiales (obviamente más caros), así disponemos de objetivos Acromáticos para corregir las distorsiones de colores que se producen en los bordes, los arcos iris, que nos hacen perder mucha nitidez en las observaciones. También tenemos objetivos Planoacromáticos para corregir además las curvaturas de los objetos hacia los bordes de la preparación que tienden a verse curvos y deformados, sin duda los más recomendados sobre todo para los objetivos más usados de 40x y 100x. Los microscopios convencionales de gama media suelen traer 4 o 5 objetivos que son intercambiables y dado que son los elementos más importantes, como los objetivos de una cámara de fotos, podemos tener unos mejores que otros, los de menos aumentos suelen se aceptables y con pocas aberraciones en todos los microscopios, sin embargo los de mayor aumento son los más problemáticos y a la vez los más importantes.
o 4x. Sin duda es el menos importante en Micología, fundamentalmente se utiliza para seleccionar la zona de observación y para ver capas generales de algunas secciones. En general cualquier que traiga el microscopio nos cumplirá el papel.
o 10x. Adecuado para ver completas estructuras relativamente grandes como pelos, cilios, algunos cistidios e incluso la disposición de capas de algunas secciones de trama de láminas, himenio, etc. En general cualquier que traiga el microscopio nos cumplirá el papel.
o 40x. Este es el objetivo más importante y más usado en la observación de hongos ya que los aumentos que nos proporciona son los adecuados para la observación de casi todas las estructuras, incluso para la medición de esporas, basidios, cistidios, etc, y por tanto recomendable disponer del mejor posible.
o 100x inmersión. El objetivo de 100x en general suele ser de inmersión que quiere decir que requiere para su observación colocar sobre el cubreobjeto una gota de aceite de inmersión para corregir el índice de refracción. Este objetivo solo se utiliza para ver detalles de esporas y sobre todo ornamentaciones de la pared esporas y para medir pequeños detalles de éstas como altura de verrugas o espinas, apículos, etc. Es el objetivo que más aberraciones da y por la necesidad de usar aceite de inmersión el más engorroso de usar, (una vez usado con una preparación ya no se puede volver usar ésta con otros aumentos inferiores porque se mancharían de aceite los objetivos). Debe ser al menos acromático e idealmente planoacromático.
- Oculares. En la parte alta por donde se mira se encuentran otras lentes, ordinariamente simples, que son los oculares. Tenemos microscopios con:
o Monoculares. Con un solo ocular para mirar con un solo ojo, para una observación ocasional es suficiente, pero para estar rato como suele requerir el estudio de los hongos la vista se cansa e incluso puede ser malo para la vista.
o Binoculares. Disponen de dos oculares regulables en achura para observar a la vez por los dos ojos, sin duda es el más cómodo y recomendable.
o Trioculares. Disponen de dos oculares regulables como el anterior y un tercer ocular arriba para acoplar una máquina de foto. Aunque para sacar fotos medianamente aceptables podemos arreglarnos con un solo ocular tanto en los microscopio monoculares como en los binoculares estos modelos son los más recomendables porque nos permiten ver la preparación directamente a través de los oculares y sacar fotos a través del tercer ocular, en los otros casos cuando colocamos la cámara de fotos ya no podemos ver directamente la preparación.
En general los oculares no son muy problemáticos, se cambian fácilmente y en ocasiones los equipos suelen llevar un par de juegos de recambio, normalmente de 10, 15 o 20 aumentos. Hay que tener en cuenta que el aumento total de lo que observamos es aproximadamente el producto de los aumentos del ocular por los del objetivo, es decir, que un objeto observado con un ocular de 10x y un objetivo de 40x los estamos viendo 400 veces aumentado.
- Ocular micrométrico. Un tratamiento aparte requiere estos oculares ya que no viene ordinariamente con los equipos y sin embargo son muy útiles o necesarios para la medición de objetos macroscópicos. El ocular micrométrico es un ocular normal pero que lleva grabada una diminuta escala que aplicada a esporas, cistidios o los elementos que queremos nos permite hacer mediciones (Ver apartado Mediciones microscópicas). Si disponemos de un ocular con lente desenroscable podemos adquirir simplemente cristalitos micrométricos que se aplican a los oculares que disponemos sin necesidad de comprar otros completos. Como se puede ver en el apartado correspondiente de Mediciones microscópicas si disponemos de cámara de fotos aplicada no son necesarios estos oculares y se mide mejor mediante fotos y con el Piximeter.
- Cámara de fotos. Aunque obviamente la realización de fotos al microscopio no sea algo rigurosamente imprescindible para el estudio de los hongos, sin embargo, como en la macroscopía, la fotografía es un recurso muy importante para dejar constancia y trasmitir a otras personas las observaciones realizadas que antiguamente se hacía por medio de dibujos o esquemas, hoy menos usadas, así como para hacer mediciones, comparaciones, etc.
Cámara de fotos y adaptador al tercer ocular
Para realizar fotografía tal como se ha indicado en el apartado anterior lo más recomendable es disponer de un microscopio triocular al que se le puede acoplar o bien pequeñas cámaras (relativamente baratas) que se venden expresamente para esto y que vienen sin objetivos, diafragmas, etc , o bien acoplando mediante un tubo adaptador un cuerpo de una cámara réflex, en ambos casos se conectan y manejan desde un ordenador anexo.
FORMA DE USO
1. Colocar la preparación del material previamente realizada (Ver Montaje preparaciones) procurando centrar lo más posible el objeto a observa en el centro del orificio de la platina.
2. Disponer el objetivo de MENOR aumento en el revólver y encender la iluminación.
3. Con ayuda de la rueda macrométrica ir subiendo la platina (o bajando el objetivo según modelos) hasta que apreciemos el objeto a observar y terminar de enfocar con la rueda micrométrica.
4. Manejar el diafragma y condensador. Abrir o cerrar el diafragma según la claridad que tengamos y la profundidad de campo que queramos conseguir y coordinadamente subir o bajar el condensador para aumentar la cantidad de luz que incide con el objeto. De manera general con los objetivos pequeños el condensador debe estar bajo y el diafragma abierto, conforme pasamos a objetivos de mayor aumento perdemos luminosidad y profundidad de campo, por lo que tenemos que cerrar el diafragma pero entonces perdemos luz y hay que subir el condesador y si se puede aumentar la intensidad de la luz desde el foco.
5. Dar un vistazo general a todo el objeto y seleccionar la parte donde creemos que está lo que queremos observar, basidios, cistidios, esporas, ascas, etc, mover la preparación suavemente con los mandos de platina para centrar esa parte en el centro de observación y como en el paso anterior controlar la luminosidad con el diafragma y condensador.
6. Pasar al siguiente aumento con el revolver colocando el objetivo progresivamente mayor. Si el microscopio está bien calibrado al cambiar de objetivo debería aparecer prácticamente enfocado el objeto o solo a falta de un pequeño retoque con el mando micrométrico.
7. Si lo que nos aparece en la preparación no es lo deseado o lo que esperábamos lo más recomendado es volver al objetivo anterior y repetir los pasos anteriores, una búsqueda con un objetivo de gran aumento suele ser complicada, ardua y en la mayoría de los casos infructuosa.
8. Si deseamos una observación a mayor aumento centrar la preparación en el punto que queremos observar y pasar al siguiente aumento. Si se nos ha movido la preparación o no nos gusta lo que vemos lo más recomendable es volver a un objetivo inferior y repetir los procesos anteriores cuantas veces sean necesarias.
9. El último objetivo a utilizar es el de 100x inmersión ya que hay que colocar sobre el cubreobjeto una gota de aceite de inmersión y ya la preparación no puede ser usada con otros objetivos. Después de su uso hay que limpiar el objetivo con un pañuelo de papel fino o un disolvente suave.
10. Cuando los objetos son muy opacos, no podemos o no queremos hacer cortes finos solo nos serán útiles los objetivos de menos aumentos y tendremos que utilizar el microscopio como una “lupa” utilizando una lámpara de fuerte luz que nos ilumine la preparación desde arriba o lateralmente y ver los objetos por reflexión.
MEDIDAS MICROSCÓPICAS
El tamaño de los elementos que observamos al microscopio es muy relativo porque depende de diversos factores como los objetivos y oculares del microscopio que utilizamos y en el caso de realizar fotografías de la propia máquina de fotos y mucho posteriormente del programa que utilizamos para visionar las fotos, zoom que les hacemos a las fotos, etc…
Esporas de Cortinarius cinnabarinus observadas con objetivo de 40 aumentos y de 100 aumentos
Así fácilmente podemos deducir que con estos medios solo podemos llegar a apreciar diferencias comparativas de tamaños entre unos elementos u otros o entre los elementos de unas muestras y las de otras, pero nunca las dimensiones reales de un determinado objeto . Para poder medir con más o menos precisión, pero objetivamente, unas esporas, unos cistidios, unas hifas o cualquier otro elemento microscópico ordinariamente seguimos dos procedimientos:
1. CON OCULAR MICROMÉTRICO. La forma tradicional de medir objetos en un microscopio es utilizando un ocular micrométrico o si es posible adaptar un cristal micrométrico a un ocular existente. En ambos casos se trata de lograr unos oculares que llevan unas escalas graduadas generalmente con 100 unidades. Estas escalas sin más no permiten medir nada si previamente no se han calibrado el valor de sus unidades con cada uno de los objetivos.
- Calibración de los distintos objetivos. Con cada uno de los objetivos hay que proceder a determinar la equivalencia en micras de la escala de unidades que posee nuestro ocular micrométrico. Para ello es necesario disponer de un portaobjetos micrométrico que se puede adquirir por internet, https://www.amazon.es/Bresser-Portaobjetos-escala-microm%C3%A9trica-100mm/dp/B001FRDSBU, que ordinariamente lleva grabado 1 mm dividido en 100 unidades de manera que cada unidad representa 10 milésimas de milímetro, es decir, 10 micras. Se cuenta el número de unidades de la escala del ocular coinciden exactamente con otras unidades del portaobjetos micrométrico y a partir de ahí una simple regla de tres nos determina el número de micras que representa cada unidad del ocular. Esto hay que repetirlo con cada uno de los objetivos.
2. CON PIXIMETRO. Si se dispone de una máquina de fotos acoplada al microscopio la mejor forma de medir estructuras es utilizando el programa gratuito piximeter.com, http://ach.log.free.fr/Piximetre/, Se trata de hacer fotos del material a medir y después con la ayuda de este programa medir cualquier estructura, el programa nos ofrece medidas directas, medias, comparaciones, gráficos de dispersión, etc. Por la misma razón que con el uso del micrométrico hay que proceder previamente a una calibración del programa, utilizando fotos obtenidas con cada uno de los objetivos del portaobjetos micrométrico con la escala de 1 mm/100. En la página que indicamos aparece todo el procedimiento muy simple para calibrar el programa.
En cualquiera de los casos y especialmente para obtener unas medidas representativas de esporas hay que proceder a medir al menos 30 a 40 unidades.